Síntesis convergente de oligonucleótidos morfolino fosforodiamidato (PMO) por el H

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12576 (2023) Citar este artículo

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Los oligonucleótidos de fosforodiamidato morfolino (PMO) son un tipo prometedor de oligonucleótidos antisentido, pero su difícil síntesis dificulta el acceso a ellos. Esta investigación presenta un enfoque sintético eficiente para PMO utilizando el enfoque de H-fosfonato. El uso de reactivos de condensación de tipo fosfonio redujo significativamente los tiempos de acoplamiento en comparación con el enfoque sintético actual. Además, los reactivos de condensación de tipo fosfonio facilitaron la condensación de fragmentos de PMO, sintetizando hasta 8 unidades que contienen las cuatro nucleobases con una notable eficacia de acoplamiento. Este es el primer informe sobre la síntesis convergente de las PMO. Este enfoque facilitaría la síntesis a gran escala de las PMO y aceleraría su popularidad y accesibilidad como terapia de próxima generación.

El enfoque antisentido ha atraído la atención de los investigadores como una posible terapia futura para controlar la expresión de genes relacionados con enfermedades1,2,3. Los oligonucleótidos de fosforodiamidato morfolino (PMO), con enlaces internucleotídicos no iónicos y una columna vertebral de morfolino, se consideran fármacos antisentido prometedores4,5. La alta afinidad de unión al ARNm4 objetivo, la especificidad de secuencia6,7, la solubilidad en agua6 y la baja toxicidad de la PMO7,8,9,10 se han confirmado en estudios previos. Hasta la fecha, se han aprobado cuatro medicamentos antisentido para la distrofia muscular de Duchenne (Exondys 51®11, Vyondys 53®12, Viltepso®13, Amondys 45®14) y se espera que se aprueben más medicamentos PMO en el futuro. Además, se sintetizó un nuevo análogo de PMO llamado oligonucleótidos de tiofosforamidato morfolino (TMO) que mostró potencial como nuevo fármaco candidato en terapia antisentido15. Los rápidos avances en las PMO han aumentado la necesidad de desarrollar enfoques eficientes para sintetizar PMO y análogos de PMO. En particular, el enfoque sintético, que puede sintetizar PMO a gran escala a la vez, es necesario para que los pacientes puedan disponer de terapia antisentido. Hasta la fecha, se han desarrollado muchos enfoques sintéticos. Summerton y Weller5 informaron del primer enfoque sintético para las PMO (Fig. 1-A). En este enfoque, se emplearon como unidades monoméricas (A) nucleósidos de morfolino que portaban un resto de N,N-dimetilaminoclorofosforamidato en el grupo 5'-hidroxi y un grupo tritilo (Tr) en el grupo amino. Las PMO se sintetizaron repitiendo la condensación del grupo 5'-N,N-dimetilaminoclorofosforamidato del monómero (A) con el grupo amino en el extremo 3' del oligómero después de la eliminación del grupo Tr en el extremo 3'5. Este enfoque se utiliza ampliamente, pero tiene varios problemas reconocidos, incluida la baja reactividad de los monómeros y los largos tiempos de reacción para completar la reacción de condensación. En 2012, Harakawa et al. descubrieron que agregar LiBr a una mezcla de reacción era efectivo y daba como resultado una aceleración considerable de la reacción (una mejora de aproximadamente diez veces)16. Además, Li et al.17 descubrieron que al aumentar la temperatura de reacción a 90 °C, la reacción de condensación se completaba en 8 minutos, lo que les permitía sintetizar un PMO 18mero en solo 3,5 h utilizando un reactor de flujo. Kundu et al.18 informaron sobre la síntesis de PMO utilizando un oligo sintetizador automatizado. En este informe, se logró una síntesis en fase de solución de PMO trimer utilizando la química Fmoc. Además, se sintetizaron PMO de 30 unidades mediante un sintetizador de ADN.

Enfoques actuales para la síntesis de derivados de PMO.

Recientemente, Langner et al.15 informaron sobre un nuevo enfoque sintético para la síntesis de TMO utilizando derivados de fosforodiamidita como monómeros (Fig. 1-B). A diferencia de la PMO, las TMO tienen un enlace fosforotioamidato, que mostró propiedades prometedoras como oligonucleótidos antisentido. Los TMO mostraron una alta afinidad de unión al ARN y una alta estabilidad de las nucleasas. Además, los TMO quiméricos exhibieron su potencial como inhibidores de microARN. Como se muestra en la Fig. 1-B, este enfoque emplea derivados de morfolino fosforodiamidita que llevan un grupo 4,4'-dimetoxitritilo (DMTr) en el grupo 5'-hidroxi (B) como unidades monoméricas. El proceso de síntesis implicó la condensación de un monómero de morfolino fosforodiamidita (B) con el grupo hidroxi en el extremo 5' del oligómero en presencia de un activador ácido, como 5-etiltio-1H-tetrazol (ETT), seguido de la sulfuración de un intermedio de fosforamidita (C). La detritilación posterior seguida de ciclos de síntesis repetitivos produjo TMO. El rendimiento de acoplamiento informado fue del 95 al 97 %, con un tiempo de reacción de condensación de 5 min15. Aunque este enfoque es eficaz para sintetizar TMO, no es aplicable a la síntesis de PMO. Este método proporcionó el derivado de fosforamidita (C) como intermedio, pero a partir de este intermedio no se obtiene el enlace fosforodiamidato deseado de PMO.

En 2015, Bhadra et al.19 desarrollaron un nuevo enfoque para sintetizar PMO de politimidina empleando la química del H-fosfonato (Fig. 1-C). En este enfoque, se emplearon nucleósidos de morfolino monoéster de 5'-H-fosfonato (D) como unidades monoméricas. Los monómeros de 5'-H-fosfonato (D) se convirtieron en intermedios de aril-H-fosfonato (E) empleando un derivado de fenol y cloruro de pivaloílo como reactivo de condensación. Luego, se condensaron intermedios de aril-H-fosfonato (E) con el grupo amino en el extremo 3' de un oligómero. La detritilación posterior seguida de ciclos de síntesis repetitivos condujo a que los oligómeros de morfolino tuvieran enlaces H-fosfonamidato internucleotídicos. Finalmente, los enlaces internucleotídicos H-fosfonamidato se convirtieron en homólogos de fosforodiamidato mediante tratamiento con yodo y dimetilamina para generar PMO. Este enfoque logró un alto rendimiento de acoplamiento (98–100%) con un tiempo de reacción de condensación corto (10 min)19. Sin embargo, este enfoque requirió la preactivación de los monómeros de H-fosfonato (D), lo que hace que los procedimientos sean más complejos.

Estudios anteriores han investigado a fondo la síntesis de H-fosfonamidato20,21,22,23. Estos estudios demostraron que una amina específica podría condensarse directamente con un monoéster de H-fosfonato utilizando un reactivo de condensación específico20,21,22,23. Con base en estos hallazgos, recientemente sintetizamos un H-fosfonamidato que tiene un grupo morfolino, condensando directamente un monoéster de H-fosfonato con morfolina usando BOPCl como reactivo de condensación24. Por lo tanto, intentamos condensar directamente el monómero de H-fosfonato del nucleósido de morfolino con el grupo amino del nucleósido de 3ʹ-morfolino utilizando un reactivo de condensación específico (Fig. 1-D).

En la mayoría de las síntesis de PMO, se utiliza comúnmente un método de síntesis lineal, en el que una unidad de monómero se acopla con un oligómero alargado (Fig. 1-E)5,17,19. Este método da como resultado la formación de N-1 mer, que es una base más corta que el producto. La separación del mer N-1 tiende a ser difícil debido a la lipofilicidad similar entre el producto deseado y el mer N-1. Para superar este problema, la condensación de fragmentos es eficaz ya que evita la formación de N-1 mer al condensar dos oligómeros juntos. Por lo tanto, la separación del producto de los fragmentos sin reaccionar se simplificaría ya que existe una diferencia significativa en la lipofilicidad entre ellos. Además, el enfoque de condensación de fragmentos reduce los pasos de reacción necesarios para sintetizar oligómeros. En la síntesis de oligodesoxinucleótidos se demostró la utilidad del método sintético convergente para su fabricación25. Sin embargo, debido a la baja eficiencia de la reacción de formación de enlaces internucleotídicos del método existente, aún no se ha investigado la condensación de fragmentos de PMO.

En esta investigación, desarrollamos un enfoque sintético eficiente para PMO utilizando derivados de monoéster de H-fosfonato como unidades monoméricas. Los reactivos de condensación de tipo fosfonio proporcionaron la formación directa de un enlace H-fosfonamidato, y este enfoque permitió la condensación del fragmento.

Primero, se sintetizaron 5'-O-terc-butildifenilsilil (TBDPS)-morfolino nucleósidos 1 y monómeros de H-fosfonato 2 a partir de 5'-hidroxi-N-tritilo (Tr)-morfolino nucleósidos de N4-benzoilcitidina (mCbz), N6-benzoiladenosina ( mAbz), N2-isobutiril-O6-cianoetilguanosina (mGi-bu,CE) y timidina (mT) (Ver SI). A continuación, se sintetizó un derivado de H-fosfonamidato de dimorfolinocitidina 3cc empleando el monómero de H-fosfonato obtenido 2c y el morfolinonucleósido 1c. Los 1,2 equivalentes de monómero de H-fosfonato 2c se condensaron con el grupo amino de 1c empleando 3,0 equivalentes de varios reactivos de condensación en CD3CN-piridina (1:1, v/v) a 0 °C durante 20 minutos (Tabla 1). La tasa de conversión se determinó mediante análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) de 31P de la mezcla de reacción a temperatura ambiente. La reacción de condensación que utiliza cloruro de pivaloilo (PivCl), que se emplea comúnmente para la reacción de condensación de la síntesis de ADN mediante el enfoque de H-fosfonato, no logró producir el producto deseado (entrada 1). Nuestra hipótesis fue que el grupo amino del nucleósido morfolino 1c reaccionó con PivCl y/o un intermedio de acil-H-fosfonato y se cerró como un derivado de amida. Sobkowska et al.20 habían confirmado previamente una reacción secundaria similar para la síntesis de derivados de H-fosfonamidato utilizando PivCl como reactivo de condensación. Por lo tanto, el resultado de la entrada 1 estuvo de acuerdo con el informe anterior. Sin embargo, el uso de reactivos de condensación como cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BOPCl) (entrada 2), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(pirrolidin-1-il)fosfonio (PyBOP) (entrada 3) , Hexafluorofosfato de 2-(benzotriazol-1-iloxi)-1,3-dimetil-2-pirrolidin-1-il-1,3,2-diazafosfolidinio (BOMP)26 (entrada 4), 3-nitro1,2,4- hexafluorofosfato de triazol-1-il-tris(pirrolidin-1-il)fosfonio (PyNTP)27 (entrada 5) y 1,3-dimetil-2-(3-nitro-1,2,4-triazol-1-ilo El hexafluorofosfato de )-2-pirrolidin-1-il-1,3,2-diazafosfolidinio (MNTP)27 (entrada 6) proporcionó el H-fosfonamidato 2-mer 3cc como producto primario. La formación de 3 cc se verificó utilizando 31P NMR (δ 13,3, 14,2 ppm, 1JPH = 661,1, 654,6 Hz). En particular, BOPCl, BOMP y PyNTP dieron 3 cc con rendimientos de RMN superiores al 98 %. BOMP, PyNTP y MNTP son reactivos de condensación que diseñamos y sintetizamos para las reacciones de condensación del enfoque de H-fosfonato en un estudio anterior26,27. Estos reactivos de condensación tienen una alta reactividad como reactivos de condensación, mientras que son menos reactivos con el grupo amino26,27. Supusimos que los reactivos de condensación de tipo fosfonio dieron resultados preferibles para formar enlaces H-fosfonamidato debido a estas ventajas. Investigaciones anteriores han demostrado que el orden de reactividad de los reactivos de condensación es MNTP > PyNTP > PyBOP. Esto podría deberse a la capacidad de los grupos salientes (HOBt o 3-nitro 1,2,4-triazol (NT)) y a la estructura del centro de fosfonio26,27. Sin embargo, en este método, PyNTP mostró un mejor resultado para la reacción de condensación. El menor rendimiento de RMN usando MNTP se debió a la formación de subproductos. Debido a la mayor actividad como reactivo de condensación, la activación de 2c por MNTP podría haber provocado una sobreactivación y una eficacia de condensación inferior. Por lo tanto, se seleccionaron BOPCl, BOMP y PyNTP como reactivos de condensación para una mayor investigación.

En resumen, logramos la condensación directa del monoéster de H-fosfonato y el grupo amino del nucleósido morfolino. Además, la reacción de condensación se completó en 20 min.

Aunque intentamos aislar el H-fosfonamidato de 2 unidades de 3 cc, 3 cc era inestable y se hidrolizaba fácilmente durante la extracción y purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice. Por lo tanto, intentamos convertir el enlace H-fosfonamidato obtenido en un enlace fosforodiamidato estable como una reacción en un solo recipiente después de la reacción de condensación.

A continuación, optimizamos las condiciones de reacción de una reacción de condensación y una aminación oxidativa como una reacción en un solo recipiente (Tabla 2). Para formar un enlace H-fosfonamidato, los 1,2 equivalentes del monómero 2 de H-fosfonato se condensaron con 1 que llevaba el grupo amino usando BOPCl o PyNTP. Luego, a 0 °C, el derivado de H-fosfonamidato 3 se transformó en un derivado de fosforodiamidato 4 añadiendo una mezcla de dimetilamina y un reactivo de halogenación (I2, CBr4 o CCl4) a la mezcla de reacción. La tasa de conversión se determinó usando análisis de RMN 31P de la mezcla de reacción. Primero, investigamos el impacto de los reactivos halogenantes en los resultados de la reacción y descubrimos que CCl4 dio los mejores resultados (ver SI). La formación de 4 cc se confirmó usando RMN 31P (δ 16,5, 16,9 ppm). Sin embargo, el rendimiento de RMN del producto deseado fue moderado (47%) usando BOPCl como reactivo de condensación (Tabla 2, entrada 1). Posteriormente, se empleó PyNTP como reactivo de condensación en lugar de BOPCl, lo que mejoró significativamente el resultado (91%, entrada 2). Supusimos que los residuos del reactivo de condensación afectaron la reacción de aminación oxidativa (ver SI). El equivalente de dimetilamina se aumentó a 38 equivalentes en la entrada 3, lo que mejoró el rendimiento de RMN al 98 %. Se cree que la reacción de aminación oxidativa del H-fosfonamidato consiste en una tautomerización al intermedio fosforamidita tricoordinado, una reacción de halogenación oxidativa con CCl4 y una aminación posterior del intermedio resultante28,29,30. Cantidades excesivas de dimetilamina funcionaron como base y aceleraron una tautomerización al intermedio de fosforamidita tricoordinada, que promueve una reacción de aminación oxidativa. El tiempo de reacción de aminación oxidativa se fijó en 1 min en la entrada 4 y el rendimiento de RMN se incrementó a >99%; por lo tanto, las condiciones de la entrada 4 se seleccionaron como óptimas. Con las condiciones de reacción optimizadas a mano, se sintetizaron 2-meros de fosforodiamidato que portaban otras nucleobases (entradas 5, 6 y 7). Todos los 2-meros se obtuvieron con rendimientos de RMN> 99%, lo que demuestra que las reacciones se desarrollaron de manera eficiente independientemente de la nucleobase específica. Aunque se utilizó dimetilamina en solución de H2O como condiciones optimizadas, no se observó la hidrólisis del enlace H-fosfonamidato. Se atribuye a la reactividad mucho mayor de la dimetilamina que la del H2O con el intermedio clorofosforamidato. Estos resultados coincidieron bastante con los informes anteriores29,30.

El producto deseado y un derivado de óxido de triaminofosfina, que era el residuo de PyNTP, no se separaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice a pesar de nuestros intentos de aislar fosforodiamidato 2-meros 4. Por lo tanto, las mezclas crudas de 4 se emplearon para sintetizar fragmentos de 2-meros. sin mayor purificación.

Analizamos la síntesis de dos tipos de fragmentos de 2 unidades empleando una mezcla cruda de fosforodiamidato de 2 unidades 4 obtenida mediante una reacción optimizada de condensación y aminación oxidativa como una reacción en un solo recipiente (Fig. 2). Primero, intentamos sintetizar un fragmento de 2 unidades que lleva un grupo amino de 5 cc a partir de una mezcla cruda de 4 cc mediante tratamiento con ácido 3-cianopiridina (CYP)-trifluoroacético (TFA) en CH2Cl2-2,2,2-trifluoroetanol (TFE) (4 :1,v/v). Después de una simple extracción y purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice, obtuvimos los 5 cc purificados con un rendimiento aislado total del 78 % (de 1c, 3 pasos). Utilizamos el mismo procedimiento para sintetizar 5gt, que se obtuvo con un rendimiento aislado del 96% (a partir de 1g, 3 pasos). A continuación, intentamos sintetizar un fragmento de 2 meros de 7 cc que contiene 5'-H-fosfonato a partir de la mezcla cruda de 4 cc siguiendo el procedimiento de la Fig. 2. Primero, eliminamos el grupo 5'-TBDPS de 4 cc usando TBAF, seguido de un simple extracción para obtener el compuesto 6cc. Se empleó el compuesto 6 cc para la siguiente reacción de fosfonilación sin purificación adicional. A continuación, se realizó la 5ʹ-O-fosfonilación de 6 cc utilizando PCl3 premezclado e imidazol como reactivo fosfonilante19. Después de una simple extracción y purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice, obtuvimos el 5'-H-fosfonato 2-mero 7 cc purificado con un rendimiento aislado general del 91% (de 1c, 4 pasos). 7ca también se sintetizó y se obtuvo con un rendimiento aislado del 88% usando el mismo procedimiento (a partir de 1c, 4 pasos). Estos dos tipos de fragmentos se separaron fácilmente de un derivado de óxido de triaminofosfina.

Síntesis de fragmentos bimerínicos.

Reactivos y condiciones: (i) 3-cianopiridina (10 equiv.), CF3COOH (10 equiv.), CH2Cl2–CF3CH2OH (4:1, v/v), ta, 1 h; (ii) TBAF (1,5 equiv.), CH3COOH (1,5 equiv.), THF, 0 °C, 1,5 h; (iii) PCl3 (5 equiv.), imidazol (17 equiv.), TEA (50 equiv.), CH2Cl2, − 78 °C, 30 min.

La síntesis exitosa de fragmentos de 2 meros impulsó la síntesis de un fosforodiamidato de 4 meros utilizando fragmentos de 2 meros de 5 cc y 7 cc a través de una reacción de condensación de fragmentos. Condensamos el H-fosfonato 2-mero 7 cc con el grupo amino de 5 cc usando PyNTP como reactivo de condensación durante 20 minutos, seguido de la reacción de aminación oxidativa empleando CCl4 y dimetilamina para producir fosforodiamidato 4-mero 9 cccc (Fig. 3). Después de eliminar los volátiles a presión reducida, la mezcla cruda resultante se examinó usando cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC), y los rendimientos de condensación se estimaron mediante las relaciones de área de 9 cccc de 4 meros a 2 meros sin reaccionar. 5 cc. El rendimiento de HPLC fue del 97 %, lo que indica que la condensación del fragmento se realizó casi cuantitativamente en 20 min. Este fue el primer ejemplo de síntesis de PMO mediante síntesis convergente. Sin embargo, BOMP, que tiene a HOBt como grupo saliente dio un resultado inferior (68%) que PyNTP, que tiene a NT como grupo saliente. Esto sugiere que la presencia de NT como catalizador nucleofílico es esencial para la reacción de condensación de fragmentos. Además, el tiempo de retención de RP-HPLC del producto 9cccc y los fragmentos de 2 unidades (5 cc y 7 cc) fueron significativamente diferentes, lo que indica una diferencia significativa en la lipofilia entre el fragmento de 4 unidades (9 cccc) y el de 2 unidades (5 cc y 7 cc). ) (Ver SI). Este resultado muestra que la síntesis convergente facilita la purificación del producto.

Síntesis de fosforodiamidato 4-mer.

Siguiendo el mismo procedimiento, se preparó un fosforodiamidato de 4 meros 9gtca que contiene cuatro tipos de nucleobases (A, C, G y T) utilizando fragmentos de 2 meros (5gt y 7ca) y PyNTP como reactivo de condensación. Después de una extracción simple, se emplearon 4-meros (9cccc y 9gtca) para la siguiente reacción, sin purificación adicional.

Posteriormente, estudiamos la síntesis de dos tipos de fragmentos de 4 meros (10 y 12) siguiendo el mismo procedimiento utilizado para la síntesis de fragmentos de 2 meros (Fig. 4). Los fragmentos de 4 unidades que portaban los grupos amino 10cccc y 10gtca se obtuvieron con rendimientos del 66% y 71% a partir de 5cc y 5gt, respectivamente (3 pasos). Además, obtuvimos los fragmentos de 4 unidades de 5'-H-fosfonato de 12cccc y 12gtca con rendimientos del 72% y 76% de 5cc y 5gt, respectivamente (4 pasos). En estas reacciones no se observaron reacciones secundarias detectables frente a las nucleobases. La pureza de estos fragmentos se confirmó mediante RMN y HPLC (Ver SI).

Síntesis de fragmentos de 4 meros.

Reactivos y condiciones: (i): 3-cianopiridina (10 equiv.), CF3COOH (10 equiv.), CH2Cl2–CF3CH2OH (4:1, v/v), ta, 1 h; (ii) TBAF (1,5 equiv.), CH3COOH (1,5 equiv.), THF, 0 °C, 1,5 h; (iii) PCl3 (5 equiv.), imidazol (17 equiv.), TEA o N-metilmorfolina (50 equiv.), CH2Cl2, − 78 °C, 30 min.

A continuación, procedimos a sintetizar PMO de 6 unidades y PMO de 8 unidades utilizando fragmentos de 2 unidades y fragmentos de 4 unidades (Tabla 3). Todos los oligómeros se sintetizaron mediante procedimientos de condensación y aminación oxidativa. Después de eliminar los volátiles a presión reducida, analizamos la mezcla cruda resultante usando RP-HPLC y estimamos los rendimientos de condensación comparando las proporciones de área de los fragmentos de 6 o 8 unidades con los fragmentos de 2 o 4 unidades sin reaccionar que llevan una grupo amino. La tabla 3 muestra los resultados. Primero, sintetizamos un 15 de 6 unidades mediante dos rutas sintéticas diferentes (Ruta A y B) para investigar el efecto de un impedimento estérico causado por la longitud de los fragmentos. En la ruta A, condensamos el fragmento 5'-H-fosfonato 2-mero 7cc con el grupo amino del fragmento 4-mero 10cccc, mientras que en la ruta B, condensamos el fragmento 5'-H-fosfonato 4-mero 12cccc con el grupo amino de fragmento de 2 meros de 5 cc. En la ruta A, utilizamos PyNTP como reactivo de condensación para la reacción de condensación para producir el 15 de 6 unidades deseado con un rendimiento de HPLC del 95 % (entrada 1). Sin embargo, en la ruta B, la reacción de condensación utilizando PyNTP como reactivo de condensación no procedió lo suficiente, lo que llevó a un rendimiento de HPLC bajo (26 %, entrada 2). Con base en estos resultados, observamos que los fragmentos más largos de 5'-H-fosfonato dieron como resultado una menor eficacia de condensación. Estos datos mostraron que el impedimento estérico de los fragmentos de 5'-H-fosfonato era crucial para la eficacia de la condensación. Sin embargo, el efecto del impedimento estérico de los fragmentos que llevan un grupo amino fue menos notable en comparación con los fragmentos de 5'-H-fosfonato. Para superar el impedimento estérico de los fragmentos de 5'-H-fosfonato, realizamos la reacción de condensación de la ruta B usando MNTP, que tiene una mayor actividad como reactivo de condensación que PyNTP (entrada 3). Para nuestro deleite, el rendimiento de HPLC aumentó al 91%. El uso de MNTP provocó reacciones secundarias y fue ineficaz para sintetizar 2-meros; sin embargo, dio el mejor resultado en la síntesis convergente debido a su alta actividad. A continuación, sintetizamos 8-mer 16 usando PyNTP y MNTP como reactivos de condensación (entradas 4 y 5, respectivamente; ruta C). Como se esperaba, MNTP proporcionó una mayor eficacia de condensación (92 %, entrada 5). Finalmente, sintetizamos otro 17 de 8 unidades con las cuatro nucleobases utilizando MNTP como reactivo de condensación (ruta D), lo que produjo un 17 de 8 unidades con un rendimiento de HPLC del 92 %. Estos hallazgos demuestran que para la condensación de fragmentos, la selección de reactivos de condensación es crucial y MNTP es el reactivo de condensación óptimo para la síntesis convergente de PMO. Además, los resultados de HPLC mostraron una diferencia significativa en la lipofilia entre los fragmentos de 8 y 4 unidades (ver SI).

En resumen, investigamos el impacto de un impedimento estérico causado por la longitud de los fragmentos y demostramos que el impedimento estérico de los fragmentos de 5'-H-fosfonato era crucial para la eficacia de la condensación. Al emplear MNTP como reactivo de condensación, pudimos superar este problema y obtuvimos 8 unidades con rendimientos de HPLC excepcionales.

Finalmente, intentamos eliminar los grupos de protección de los 8-meros 16 y 17 completamente protegidos mediante el siguiente procedimiento: detritilación, eliminación del grupo TBDPS, desprotección de nucleobases y purificación mediante cromatografía en columna ODS (Fig. 5). Obtuvimos 8-mers 18 y 19 purificados con rendimientos del 73% y 79% de 10cccc y 10gtca, respectivamente (5 pasos). Las cantidades de producto fueron suficientes para la caracterización mediante ESI-MS, 1H NMR y 31P NMR.

Desprotección y aislamiento de 8-meros.

Reactivos y condiciones: (i) 3-cianopiridina (40 equiv.), CF3COOH (40 equiv.), CH2Cl2–CF3CH2OH (4:1, v/v), ta, 1 h; (ii) TBAF (40 equiv.), THF, ta, 2 h; (iii) NH3 acuoso concentrado-EtOH (3:1, v/v), 55 °C, 16 h; (iv) cromatografía en columna de fase inversa.

En este estudio, hemos desarrollado un método novedoso para la síntesis de PMO en fase de solución utilizando un enfoque de H-fosfonato. Condensamos directamente los monómeros de H-fosfonato con el grupo amino de morfolinonucleósidos utilizando reactivos de condensación de tipo fosfonio específicos, incluidos PyNTP, BOMP y MNTP. El enlace H-fosfonamidato resultante se convirtió en una contraparte estable de N,N-dimetilamino fosforodiamidato como una reacción en un solo recipiente. Estas reacciones redujeron sustancialmente el tiempo de acoplamiento y produjeron el producto cuantitativamente. Los oligómeros obtenidos se convirtieron en fragmentos (monoéster de 5'-H-fosfonato y derivados de 3'-NH) para la siguiente reacción de condensación y se aislaron con rendimientos sustanciales. Logramos la condensación de fragmentos con una notable eficacia de condensación para sintetizar hasta 8 unidades utilizando estos fragmentos. Este es el primer informe sobre la síntesis en fase de solución de PMO utilizando una reacción de condensación de fragmentos. La condensación de fragmentos impidió la formación de N-1 mero del producto, lo que facilitó el aislamiento del producto. Además, dado que este enfoque produce H-fosfonamidato como intermedio, se obtendrían varias PMO modificadas con P, como las TMO, mediante una transformación adecuada del intermedio28. El enfoque de este estudio es una alternativa eficaz para sintetizar las PMO. Debería estudiarse más a fondo la síntesis de varias PMO modificadas con P utilizando el derivado H-fosfonamidato.

Se secaron un nucleósido de morfolino 1c (0,0284 g, 0,050 mmol) y un monómero de H-fosfonato 2c (0,0473 g, 0,060 mmol) mediante coevaporación repetida con piridina seca y se disolvieron en una mezcla de piridina seca (0,5 ml) y acetonitrilo-d3 ( 0,5 ml). Se añadió un reactivo de condensación (0,15 mmol) a la solución a 0 °C y la mezcla se agitó durante 15 min a 0 °C. La solución se transfirió a un tubo de muestra de RMN (5 mm x 180 mm) y se registró un espectro. La formación de 3 cc se confirmó mediante espectros de RMN de 31P (δ 14,2, 13,3 ppm, 1 JPH = 655, 661 Hz) (Fig. S1-S6).

Se secaron un nucleósido de morfolino (1a, 1g, 1c o 1t, 0,050 mmol) y 5'-H-fosfonato (2a, 2g, 2c o 2t, 0,060 mmol) mediante coevaporación repetida con piridina seca y se disolvieron en una mezcla de piridina (0,5 ml) y acetonitrilo-d3 (0,5 ml). Se añadió un reactivo de condensación (0,15 mmol) a la solución a 0 °C y la mezcla se agitó durante 20 min a 0 °C. A la mezcla de reacción, se le añadió un reactivo de halogenación (I2, CBr4 o CCl4) y dimetilamina a 25 °C o 0 °C y la mezcla se agitó durante el tiempo diseñado a 25 °C o 0 °C. La solución se transfirió a un tubo de muestra de RMN (5 mm x 180 mm) y se registró un espectro. La formación de 4cc, 4aa, 4gg o 4tt se confirmó mediante espectros de RMN de 31P (4cc: δ 16,9, 16,5 ppm, 4aa: 16,8 ppm, 4gg: 16,9, 16,7 ppm y 4tt: 17,0, 16,8 ppm) (Fig. S7 –S21).

Se utilizó el siguiente procedimiento para la condensación de fragmentos. El fragmento de 2 o 4 unidades que lleva el grupo 3'-NH (5 μmol) y el fragmento de 2 o 4 unidades que lleva un monoéster de H-fosfonato en el grupo 5'-OH (7,5 μmol) se secó mediante coevaporación repetida con piridina seca. y se disolvió en una mezcla de piridina seca (50 μL) y acetonitrilo (50 μL). Se añadió un reactivo de condensación (30 µmol) a la solución a 0 °C y la mezcla se agitó durante 20 min a 0 °C. A la mezcla, se le añadió CCl4 (10 µl, 100 µmol) y una solución acuosa de dimetilamina 9,5 M (20 µl, 190 µmol) a 0 °C y la mezcla se agitó durante 1 min a 0 °C. Luego, la mezcla se diluyó con CHCl3 (3 ml) y se coevaporó con CHCl3 (3 x 3 ml) y tolueno (2 x 3 ml). El residuo se analizó por RP-HPLC. La RP-HPLC se realizó con un gradiente lineal de 0–60 % de MeCN durante 60 minutos en un tampón de acetato de trietilamonio 0,1 M (pH 7,0) a 50 °C a un caudal de 0,5 ml/min utilizando una columna C18 (100 Å, 3,9 mm × 150 mm). Los rendimientos de condensación se estimaron mediante las raciones de área del fragmento de 4, 6 y 8 unidades al fragmento de 2 y 4 unidades sin reaccionar que lleva el grupo 3'-NH.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en la Información de respaldo de este artículo.

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Agradecemos a la Sra. Fukiko Hasegawa, al Dr. Yayoi Yoshimura (Universidad de Ciencias de Tokio) y a Takayoshi Torii (Ajinomoto Co.) por las mediciones del espectro de masas. Nos gustaría agradecer a Enago (https://www.enago.jp) por la revisión en inglés. Este trabajo fue apoyado por JST, el establecimiento de becas universitarias para la creación de innovación en tecnología científica, subvención número JPMJFS2144 y AMED con el número de subvención JP21ae0121025.

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Taiki Tsurusaki, Kazuki Sato, Hiroki Imai y Takeshi Wada

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Kunihiro Hirai y Daisuke Takahashi

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TW estableció los planes de investigación. TT realizó los experimentos. Todos los autores analizaron los datos. TT escribió el manuscrito. KS y TW revisaron el manuscrito. Todos los autores han aprobado la versión final del manuscrito.

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Tsurusaki, T., Sato, K., Imai, H. et al. Síntesis convergente de oligonucleótidos de morfolino fosforodiamidato (PMO) mediante el enfoque de H-fosfonato. Representante científico 13, 12576 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38698-2

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Recibido: 27 de abril de 2023

Aceptado: 13 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38698-2

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